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基因编辑又称基因组编辑或基因组工程，是一种新兴的、比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术。2020年诺贝尔奖化学奖颁给了来自加州大学伯克利分校和德国马普感染生物学研究所的两位科学家，以表彰她们发明了“CRISPR-Cas9”基因编辑工具，基因编辑领域再次成为研究的热点。作为一种直接对遗传物质中的特定序列进行定点敲除、插入或突变的技术，基因编辑最早为同源重组，通过将外源DNA导入受体细胞，目的基因取代原有基因，促使特定基因失活或缺陷基因修复。随着对基因编辑技术的不断探索，新型核酸酶的发现使基因编辑技术发生了质的飞跃。

目前，基因编辑技术已经从第一代锌指核酸酶(ZFNs)、第二代转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)发展到目前的第三代CRISPR-Cas技术。CRISPR-Cas技术具有效率高、操作快捷、效果准确等优点，是目前基因编辑的主流技术，尤其是Ⅱ型的CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a(Cpf1)、CRISPR/Cas13基因编辑技术；除此以外，还有基于CRISPR/Cas系统开发的单碱基编辑(BE)和先导编辑（PE）技术等，已在多种生物体系中得到广泛应用。新技术的诞生与发展，不仅使其作为更精准、更高效的基因研究工具被开发，也因其在基因筛选、模型构建、机制研究中发挥了不可替代的独特作用，为疾病治疗提供了新思路、新范式。

基因编辑相关文章发展趋势

一、基因编辑技术的简介

ZFNs又称锌指蛋白核酸酶，由锌指蛋白构成的DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。锌指蛋白中含有数量不等的锌指基序，每个锌指基序都要通过与Zn2+结合形成类似“手指”的稳定结构，这些锌指能够介导蛋白质与核酸、小分子或其他蛋白质的特异相互作用。与转录因子相似，锌指能够特异性识别DNA上的三个核苷酸并与之结合，来调控基因的表达。利用锌指蛋白的这一特性，设计特定的锌指基序得到能够识别靶点DNA的锌指蛋白，再将特异性的锌指蛋白与非特异性核酸内切酶相融合，就能得到可以特异切割靶位点锌指核酸酶。相对于传统的基因重组方法，ZFNs技术显著提高了基因组靶向修饰的效率，而且具有高度特异性和精确性。但ZFNs技术易产生脱靶现象，FCD的异源二聚体是造成脱靶效应的主要原因，因此，该技术存在较大的改进空间。

TALENs也是由两部分组成：一部分是类转录激活因子样效应蛋白（TALE），负责对目标序列的识别与结合，另一部分是与ZFN相同的FokI核酸酶。人为地将功能性核酸内切酶FokI融合到DNA结合域上，以创建位点特异性DSB，从而刺激DNA重组以实现TALEN诱导的靶向基因组修饰。为了切割靶DNA的两条链，必须将FokI切割结构域二聚化。因此，像锌指一样，这种TALEN模块被成对设计以结合相对的DNA靶基因座，两个结合位点之间具有适当的间隔（12-30bp）。但是，与锌指蛋白相比，TALENs不需要重新设计构成长TALEN阵列的重复序列之间的连接，这些序列可靶向单个基因组位点。在锌指蛋白的开创性工作之后，多个效应子域已变得可用于支持TALE重复序列的融合，以实现不同的基因组修饰目的，包括核酸酶，转录激活因子和位点特异性重组酶。

3、CRISPR/Cas

CRISPR广泛存在于原核生物中，由一系列来自噬菌体或质粒DNA的间隔序列区和高度保守的重复序列区组成。CRISPR/Cas中的CRISPR即成簇规律间隔短回文序列，由间隔排列的repeat序列和spacer序列组成，每两个repeat序列中间夹着一个spacer序列。repeat序列在同一细菌中基本不变，而spacer序列则来自于曾入侵细菌的外源基因。

CRISPR/Cas的工作原理：获得目的序列（adaption)、CRISPRRNA成熟（crRNAmaturation）以及干涉（inteference）三个部分。在adaption阶段，Cas蛋白会通过PAM识别出外来基因片段，并将外源DNA切除整合到CRISPR序列中，使CRISPR/Cas系统拥有获得性免疫及遗传基因。当获得目的序列后，CRISPR序列前的启动子会启动整个CRISPR序列的转录，所得到的转录产物是一条连续的RNA，包含CRISPR序列中的spacers和repeats，也被称为前crRNA序列（pre-crRNA），之后pre-crRNA会在相关酶的作用下被剪切成能与目的基因碱基互补的成熟crRNA，这就是所谓的crRNAmaturation阶段。在inteference阶段，前期所得的crRNA与Cas蛋白组成核酸酶复合物，引导Cas蛋白去剪切目的基因中的基因，从而中断外源基因的表达。

由于ZFNs需要调整结构域，以及TALENs需要调整氨基酸模块才能识别不同的DNA序列，相较前两代基因编辑方法，CRISPR/Cas的优势显著：1）实现了RNA-DNA的匹配，设计方便，可操作性强，大幅缩短了动物模型的构建时间；2）有效降低了转基因动物的构建成本；3）具有精准的靶向性，能够实现模式动物基因的定点编辑。

（1）CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9主要由Cas9蛋白和单链向导RNA（sgRNA）所组成，其中Cas9蛋白起切割DNA双链的作用，sgRNA起向导的作用，在sgRNA的向导下通过碱基互补配对原则，Cas9蛋白可对不同的靶部位进行切割，实现DNA的双链断裂。该系统与其他系统的区别在于，只需一个短RNA序列，就能利用Cas9蛋白来识别、结合并切割靶DNA，形成DSB。CRISPR/Cas9的使用避免了蛋白质工程开发针对特定DNA靶序列的位点特异核酸酶的需要，大大简化了基因编辑设计和实现所需的时间。

（2）CRISPR/Cas12

Cas12a核酸酶为V型的A亚型，与crRNA组合成CRISPR/Cas12a(CRISPR/Cpf1)。Cas12a核酸酶对前体crRNA剪切得到成熟的crRNA，crRNA引导其靶向切割DNA。Cas12a核酸酶包含两个特殊的结构域，RuvC结构域可直接靶向剪切DNA，而Nuc结构域需利用RuvC结构域间接发挥功能。与CRISPR/Cas9相比，因Cas12a核酸酶相对分子质量比Cas9小，只有1200~1300个氨基酸，更易利用载体实现递送，且Cas12a核酸酶剪切时产生黏性末端，而非Cas9剪切的平末端，有利于NHEJ，使基因更精准地插入。此外，CRISPR/Cas12a系统没有tracRNA，只包含crRNA和Cas12a蛋白，其crRNA大约只有42nt，与CRISPR/Cas9系统相比，其编辑效率更高。

（3）CRISPR/Cas13

在CRISPR/Cas13a系统中，crRNA的碱基数量只有24个，是CRISPR/Cas系统中最少的，又因其不包含tracRNA，其反应速率较高。通过解析Cas13a核酸酶结构发现，crRNA和靶向RNA激活的Cas13a核酸酶能剪切任意的单链RNA。Cas13a核酸酶识别间隔区附近的PFS区序列为3′-A、3′-U及3′-C，将CRISPR/Cas系统的识别范围进一步扩大。目前，CRISPR/Cas13a系统已成功编辑了胰腺癌突变基因KRAS，对其编辑效率高达70%。此外，Cas13b核酸酶属于Ⅵ型的B亚型，与crRNA组合为CRISPR/Cas13b系统；Cas13d属于Ⅵ型的D亚型，在黄化瘤胃球菌XPD3002中被发现，可特异性靶向切割RNA，具有高的切割活性，且体积小，更易于包装到腺相关病毒(AAV)中以进行体内递送，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。

2016年，Komor等将核酸酶活性缺陷的dCas9与胞嘧啶脱氨酶(CyD)融合构建了胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)，靶向位点的胞嘧啶(C)脱氨基变成尿嘧啶(U)，随着DNA复制后，U被胸腺嘧啶(T)取代，互补链的鸟嘌呤(G)会替换为腺嘌呤(A)。2017年，Liu等在BE3基础上引入突变以减少脱靶，开发出高保真的碱基编辑器(HF-BE3)，随后，利用E.coliTadA(ecTadA)在BE基础上开发出新型单碱基编辑器——腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)，实现了A向G的精准转换，其编辑效率可达约50%，插入或缺失的引入频率<0.1%。目前，BE已实现嘧啶与嘧啶、嘌呤与嘌呤之间的自由转换。虽然CBEs、ABEs能高效地编辑某些特定靶点，但并非所有靶点均可编辑。

2019年，Anzalone等开发出一种全新的精准基因编辑工具PE，无需额外的DNA模板便可有效实现12种单碱基的自由转换，且能有效实现多碱基的精准插入(最多可插入44bp)与删除。PE系统以CRISPR/Cas9为基础，在sgRNA3'末端增加一段RNA序列，新获得的RNA被称作pegRNA。在pegRNA的引导下，Cas9H840切口酶切断含PAM的靶点DNA链，断裂的靶DNA链与pegRNA的3'末端引物结合位点序列互补并结合，随后逆转录酶发挥功能，沿逆转录的模板序列开始逆转录反应，反应结束后DNA链的切口处会形成处在动态平衡中的5'-和3'-flap结构，5'-flap结构的DNA链无任何突变，被结构特异性内切酶识别并切除，而3'-flap结构的DNA链携带有目标突变，经DNA连接和修复以实现精准的基因编辑。第一代编辑工具PE1，经293T细胞验证，PE1的点突变效率为0.7%~5.5%，碱基的增加/删除效率为4%~17%；第二代编辑工具PE2，其点突变效率和碱基的增删效率是PE1的两倍以上；在PE2基础上，增加可切断非编辑链的sgRNA，得到新的PE3和PE3b系统，其编辑效率与PE2相比提升了近3倍，在293T细胞中最高编辑效率可达78%。

二、三种技术的市场规模

根据AlliedMarketResearch，2020年CRISPR/Cas技术占据了基因编辑市场中最大的份额，未来相对于ZFNs和TALENs技术也会实现更快的市场规模增长。根据弗若斯特沙利文预计，2020年基因编辑服务全球市场规模为35亿美元，中国市场规模为人民币30亿。

重点企业及药物介绍

欧美基因编辑已产业化，科研转化落地的效率高，拥有多家基因编辑上市公司如CRISPR、Sangamo、Intellia、Editas等。国内的基因编辑技术在科研场景应用已比较成熟，而在基因治疗产业化上还有很大空间。

1、EditasMedicine

EditasMedicine成立于2013年，这是一家基于CRISPR/Cas9专利技术开发针对遗传疾病和癌症基因编辑治疗的公司，也是第一家上市的CRISPR基因编辑公司。公司旗下共有9条在研管线，包括体内基因编辑疗法、体外基因疗法以及细胞治疗项目。其中，基因编辑治疗进展更快，均有管线进入临床研究阶段；针对癌症的细胞治疗项目进展略慢，处于临床前研究阶段。

EDIT-101是一种体内CRISPR/Cas9基因组编辑药物，用于治疗遗传性失明疾病Leber先天性黑蒙10型（LCA10）。LCA10是由于CEP290基因中的双等位基因功能丧失突变引起，最常见的LCA10突变位点是IVS26。公司将编码Cas9的基因和两个指导RNA（gRNA）装载进AAV5病毒载体，然后通过视网膜下注射直接注射到患者感光细胞附近，将基因编辑系统递送到感光细胞中。当感光细胞表达基因编辑系统时，gRNA指导的基因编辑可以消除或逆转CEP290基因上致病的IVS26突变，从而改善感光细胞功能，为患者带来临床益处。目前，EDIT-101已获得FDA的罕见儿科疾病和孤儿药称号，以及EMA的孤儿药称号。2022年11月，Editas公布了EDIT-101的1/2期Brilliance试验的临床数据。数据显示，EDIT-101适用的患者数量较少，因此决定暂停BRILLIANCE试验的招募工作，并寻找合作伙伴继续开发EDIT-101。

2、IntelliaTherapeutics

Intellia是基因编辑领域的明星企业，基于CRISPR/Cas9技术，针对ExVivo(离体)与InVivo(在体)基因治疗建立了针对罕见遗传疾病、感染性疾病、免疫肿瘤学、血液疾病、自身免疫性疾病等领域的多样化在研管线，并取得优异的临床表现。

NTLA-2001是首款进入临床阶段的基于非病毒平台的体内基因编辑疗法，利用LNP作为递送载体，LNP颗粒内部含有靶向TTR基因的gRNA和编码Cas9蛋白的mRNA，系统给药后可敲除肝脏细胞编码TTR的基因。2022年9月，Intellia公布基因编辑管线NTLA-2001的临床1期中期数据：在针对转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病（ATTR-CM）患者，单次注射0.7mg/kg或1.0mg/kg的NTLA-2001，在第28天检测到血清ATTR蛋白分别降低93%和92%；在随访期达到6个月的患者中，ATTR蛋白平均降低93%。在安全性上，12位患者中仅有1例3级TERE。

NTLA-2002是一种全身性给药的疗法，旨在通过LNP递送CRISPR/Cas9系统，对激肽释放酶B1基因（KLKB1）进行基因组编辑，从而特异性关闭KLKB1基因的表达，永久性降低激肽释放酶水平，以达到治愈遗传性血管水肿（HAE）的目的。HAE是一种罕见的遗传性疾病，其特征主要表现为身体各器官和组织发生严重、反复和不可预测的炎症发作。HAE常由于补体C1抑制物（C1-INH）缺陷或功能障碍导致局部肿胀和疼痛。目前，针对HAE的治疗需要患者通过每周2次的长期静脉或皮下给药，或每日口服给药等途径进行终生治疗，但依然面临疾病突然发作的风险。2022年11月，Intellia在2022ACAAI年会上公布了NTLA-2002的1/2期临床研究的最新中期数据，结果显示，接受NTLA-2002治疗的HAE成人病患血浆激肽水平大幅度下降且HAE发作次数降低，NTLA-2002具有功能性治愈HAE的潜力。

3、CRISPRTherapeutics

CRISPR是一家领先的基因编辑公司，专注于使用其专有的CRISPR/Cas9平台开发用于在治疗严重疾病的变革性基因药物。CRISPR在广泛的疾病领域建立了一系列治疗计划，其管线涉及血红蛋白病，肿瘤学，再生医学和罕见病。

Exa-cel由CRISPR和Vertex共同开发，是一款自体、体外CRISPR/Cas9基因编辑疗法。通过在体外对患者的造血干细胞进行改造，使红细胞中产生高水平的胎儿血红蛋白（HbF）。HbF是可以携带氧气的血红蛋白，在出生时自然存在。通过exa-cel治疗，可以提高HbF水平，有可能缓解TDT患者的输血需求，并减少SCD患者的疼痛和血管闭塞性危象（VOC）。目前，Exa-cel已获得FDA授予治疗输血依赖性β-地中海贫血（TDT）和严重镰状细胞病（SCD）的再生医学先进疗法（RMAT）认定、以及快速通道和孤儿药资格。2022年9月，Vertex已向美国FDA递交Exa-cel的滚动上市申请，有望成为首款获得FDA批准的CRISPR药物，预计将在2023年第一季度末完成提交。此外，Vertex已经完成了与EMA和MHRA关于支持exa-cel上市申请所需数据的讨论，并有望在2022年底前向欧盟提交上市申请。

CTX130一种健康供体衍生的基因编辑的异体CAR-T研究性疗法，靶向CD70。CD70是一种在各种实体瘤和血液学恶性肿瘤上表达的抗原，CTX130属于CRISPR的第三代CAR-T产品，这种细胞在健康供体T细胞的基础上进行了三次修改，目前正在进行两个独立的1期单臂、多中心、开放标签临床试验，旨在评估CTX130在成年患者中的几个剂量水平的安全性和有效性。目前，该疗法得了FDA授予的再生医学高级疗法（RMAT）认证，针对皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），真菌病和塞扎里综合征（MF/SS），此前已经获得了FDA的孤儿药认定。

CTX110是利用CRISPR基因编辑技术改造的同种异体CAR-T细胞疗法。2021年10月，CRISPR公布了CTX110在治疗CD19阳性B细胞瘤的CARBONI期临床试验中获得积极安全性和疗效结果。数据显示：26名大B细胞淋巴瘤患者接受CTX110治疗并随访至少28天后，在接受剂量超过108个细胞的CTX110治疗的患者中，ITT人群的ORR为58%，CR为38%；在接受治疗6个月后，ORR为21%，最长的缓解持续时间超过18个月。在安全性上，没有出现GvHD，所有的细胞因子释放综合征（CRS）均为1级或2级；在接受CTX110再次给药的患者中，CRS的频率和严重程度都没有增加；只有一例同时患有HHV-6脑炎的患者出现3级以上的免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。2021年11月，FDA授予CTX110RMAT认证。2022年2月CTX110已完成关键性临床的第一例患者给药，预计2022年内会公布更多数据。

4、CaribouBiosciences

Caribou是一家处于临床阶段的CRISPR基因组编辑生物制药公司，致力于为罹患危及生命疾病的患者开发变革性疗法。公司基于基因组编辑平台，包括其专利的Cas12achRDNA技术，使开发细胞治疗具有更高的精确性和增强的持久性。目前，公司正在开发一种现有的CAR-T和CAR-NK细胞疗法，用于治疗血液病和实体瘤患者。

CB-010是一种异体抗CD19CAR-T细胞疗法，使用Cas9CRISPR杂交RNA-DNA(chRDNA)技术将CD19特异性CAR插入TRAC基因，去除PD-1，以提高抗肿瘤活性的持久性。目前，CB-010已经在1期临床试验中获得积极结果，是首款获得100%总缓解率的同种异体CAR-T疗法，也是首款携带PD-1敲除的临床期同种异体CAR-T疗法。

5、MammothBiosciences

Mammoth成立于2017年，公司专有的CRISPR平台可以发现和改造新型Cas酶，包括Cas14和Cas?在内的超小型Cas酶专有工具包，允许将扩展的高保真基因编辑与靶向系统递送相结合，具有优越的体内应用潜力。今年1月，Mammoth与拜耳（Bayer）宣布达成超10亿美元合作，旨在将前者的CRISPR平台与后者诱导多能干细胞平台有机结合，开发下一代体内基因编辑疗法。

6、ScribeTherapeutics

Scribe是一家分子工程公司，致力于开发和设计基于CRISPR的新疗法。公司专注于一种名为CasX的新型核酸酶，它源于自然界中一类“不可培养的细菌”，经过JenniferDoudna教授实验室的改造，最终成功应用于基因编辑。与其他CRISPR-Cas基因组编辑系统相较，CasX由于体积小、独特DNA剪切特性、来自非致病微生物等而具有许多重要的优势。公司已与赛诺菲（Sanofi）达成一项高达10亿美元的合作，利用定制的CasX编辑器协助赛诺菲扩展其NK细胞疗法在癌症治疗方面的运用。

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